研究目的

过量摄入食盐会升高血钠浓度，进而诱发心血管疾病、高血压及终末器官损伤等多种健康问题。在保证食品咸味感知强度的前提下降低钠盐添加量，即“减盐不减咸”，已成为食品科学领域的核心研究课题之一。咸味肽作为一类能够在口腔内引发咸味感知的呈味肽，具有天然、健康、易吸收且不增加钠离子摄入的优势，被认为是理想的食盐替代品。然而，当前咸味肽的发掘主要依赖酶解结合传统分离纯化技术（如凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱及液相色谱-串联质谱等），虽准确性较高，但普遍存在分析周期长、对操作人员专业技能要求高等局限，难以满足新型咸味肽高通量筛选的需求。近年来，以深度学习为代表的人工智能技术为呈味肽的快速发掘提供了全新范式。昆虫作为生物活性肽的优质蛋白来源，近年来受到广泛关注。文献报道，蝗虫蛋白质含量最高可达干物质重的85.67%，展现出极高的开发潜力。为此，本研究以蝗虫蛋白为研究对象，通过整合深度学习、虚拟酶解与分子对接，构建咸味肽高通量预测与机制解析框架，旨在从蝗虫蛋白中发掘新型咸味肽并阐明其与TMC4受体的分子互作机制。 

研究方法

咸味肽的智能筛选

本研究从BIOPEP-UWM数据库及风味数据库收集310条独特肽序列的平衡数据集用于模型训练。

模型采用MetaAI团队提出的蛋白质语言大模型——演化尺度建模寒武纪版（Evolutionary scale modeling cambrian，ESMC）作为序列编码器，将肽序列补齐至统一长度后输入ESMC模型，提取每一条肽序列的嵌入表征。该模型能够将序列结构与深层语义信息联合编码，为后续分类模型提供高质量序列表示。同时，采用两亲性伪氨基酸组成（Amphipathic pseudo amino acid composition, APAAC）描述符提取肽序列的全局理化特征，反映肽的全局组成与理化趋势，为模型提供整体层面的生物化学信息。通过融合序列表征与物化特征构建咸味肽筛选模型，实现咸味肽的智能筛选。

从NCBI数据库获取蝗虫蛋白序列（accession No：BBC81926）。利用ExPASy PeptideCutter工具选用胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）、胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）和胰凝乳蛋白酶（EC 3.4.21.1）进行虚拟酶解。上述酶系与人体胃肠道消化酶分布特征一致，其水解产生的肽段通常具有呈味活性，且能保证酶解产物的结构多样性。利用咸味肽筛选模型，对经虚拟酶解后获得的候选肽段进行咸味潜力评估，判断肽段是否具有咸味特征。此外，分别利用Peptide Property Calculator计算肽段分子质量及水溶性，并通过ToxinPred进行毒性预测。最终从候选咸味肽中筛选得到分子质量小于1 ku、无毒且具有良好水溶性的序列。综合上述指标，最终筛选得到46条候选咸味肽。

分子对接

对46条候选咸味肽与TMC4受体蛋白（UniProt ID：Q7Z404）进行半柔性分子对接，以预测其结合模式并揭示呈咸机制。采用AlphaFold2构建TMC4受体蛋白三维结构，利用AutoDock软件对受体模型进行处理，具体操作包括去除水分子并添加氢原子。基于UCSF Chimera 1.14软件构建肽分子三维结构并进行能量最小化以获得最优构象，通过AutoDock软件对肽结构进行预处理，包括加氢、加电荷和设置扭转键。基于AutoDock Vina进行TMC4受体与咸味肽的分子对接，对接盒子中心坐标x=-1.993、y=3.322、z=-10.889，尺寸x=80、y=88、z=116。结合能低于-20.92 kJ/mol视为活性成分与靶蛋白之间具有强亲和力。利用PyMOL和LigPlot+分析最优构象，鉴定咸味肽与TMC4受体结合过程的关键氨基酸残基及相互作用力类型。

蝗虫源咸味肽制备与感官评价

从46条候选咸味肽中选择并合成了3条新型肽DQH、SQADSH和EHM，进行感官评价，以验证其咸味特性。试验招募15名经标准化培训的感官评价员（男性7名，女性8名，年龄20~26岁）进行合成肽感官评价试验。感官评价测试在感官实验室中进行，环境温度控制在（25±2）℃。试验采用“入口—吐出”法。肽的味觉属性（1 mg/mL）采用定量描述分析法进行评估，阈值通过3点强制选择法进行测定：将肽样品溶解于超纯水中，配制1 mg/mL母液，然后按1∶1体积比梯度稀释制备系列浓度溶液，采用3点强制选择法测定各浓度下的正确检出概率，使用S型曲线拟合概率数据，将正确检出概率为50%对应的溶液浓度定义为该肽的感官检测阈值。

结果

基于APAAC与ESMC融合特征构建的咸味肽筛选模型在各项指标上均优于单一特征模型，其准确率、精确率、召回率和F1分数分别达到0.929，0.939，0.925和0.927。不同特征表征的t-分布随机邻域嵌入（t-Distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）分布表明，与单一特征相比，融合特征空间中咸味肽与苦味肽的判别边界更为清晰，证明了融合策略的有效性。氨基酸残基重要性分析表明，精氨酸（Arg，R）、甲硫氨酸（Met，M）与谷氨酸（Glu，E）对模型识别咸味特征具有较高贡献，注意力权重分别为0.327，0.284与0.265。

分子对接结果显示，46条肽均能成功对接至TMC4蛋白的内部结合口袋，且结合能均低于-20.92 kJ/mol。稳定对接的8条肽为：DQH（-31.38 kJ/mol）、SQADSH （-30.96 kJ/mol）、EHM（-30.96 kJ/mol）、ASPGDGR（-30.96 kJ/mol）、VDVT（-30.96 kJ/mol）、QQH（-30.96 kJ/mol）、PAER（-30.96 kJ/mol）和SPQAGR（-29.28 kJ/mol），其显示了更低的结合能，并形成稳定的结合构象。参与结合的主要氨基酸残基包括Cys475、Gln377、Glu235、Gly242、Leu618、Ala578、Arg580、Glu378、Leu217、Lys471、Thr478和Thr58。此外，氢键和疏水相互作用是驱动咸味肽与TMC4蛋白结合的关键驱动力。

选取并合成DQH、SQADSH和EHM 3条肽进行感官评价。试验结果显示3条肽均呈现咸味。其中，肽EHM表现出多种味觉特征，可能由于其复杂的结构以及其与多种味觉受体同时相互作用的能力。3条肽的检出阈值介于52.74~256.68 mg/L之间。其中，SQADSH的阈值最低，为52.74 mg/L，其次是EHM（100.02 mg/mL）和DQH（256. 68 mg/mL）。

结论

本研究基于APAAC与ESMC融合特征成功构建了咸味肽预测模型，实现了咸味肽的高效筛选，其准确率、精确率、召回率和F1分数分别达到0.929，0.939，0.925和0.927。可解释性分析结果表明，精氨酸、甲硫氨酸与谷氨酸的平均注意力值分别为0.327，0.284与0.265，表明其对模型识别咸味特征具有较高的相对贡献。蝗虫蛋白经虚拟酶解、多指标筛选及呈咸能力预测，共鉴定出46条咸味肽分子对接结果表明，所筛选肽均能成功对接至TMC4蛋白的内部结合口袋，且与TMC4的结合以氢键和疏水相互作用为主导，Cys475、Gln377、Glu235、Gly242及Leu618是参与相互作用的关键氨基酸残基。通过感官评价验证，合成肽DQH、SQADSH和EHM均具有咸味特征，阈值分别为256.68，52.74 mg/L和100.02 mg/L，证实了双分支融合策略构建的咸味肽预测模型能够有效预测和筛选咸味肽。该研究建立的“深度学习预测—虚拟酶解筛选—分子机制解析”集成框架，为昆虫蛋白源咸味肽的高通量筛选及“减盐不减咸”策略的探索提供理论依据与方法借鉴。

本研究将蛋白质语言大模型ESMC引入咸味肽预测领域，利用深层序列语义编码替代传统人工特征工程；设计了基于交叉注意力机制的双分支融合架构，实现全局理化信息对序列关键位置的动态引导，以揭示其呈味机制；将预测模型与虚拟酶解、分子模拟整合，构建了从肽链发掘到机制验证的框架，验证了蝗虫源蛋白可作为新型咸味肽的来源。所建立的智能筛选方法为昆虫源呈味肽的开发利用提供了参考。

原文链接：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=gvg-iIm8s3OqO9NMOnKE2PZtzL95kOaJ5H0u5-p2JyQSAv8PGFHq2z4kUBXAOSMtzioHzDRUjHH1_YuxInFsStVBS2ymTP16sE0h5ButXh8OtX6JNIgGIeKgN34ZCNGUMd51gUxPtVN6ybpa7xVkOLF2sheSYxmCdjXwBhsOFq1PgzG2CUc1fg==&uniplatform=NZKPT&language=CHS