海南大学张家超教授团队 | 基于单细胞拉曼分选技术的海南糟粕醋乳酸菌的分离鉴定/中国食品科学技术学会

为研究糟粕醋中微生物的物种分布情况，对糟粕醋样本进行宏基因组测序，并分别在属水平和种水平上进行物种相对丰度注释。在种水平上，筛选相对丰度前20的菌株（图1a）。结果发现，糟粕醋中相对丰度较高的菌种主要为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）、桥粘液乳杆菌（Limosilactobacillus pontis）和发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）以及酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），其相对丰度分别为13.7%，14.0%，5.5%，5.0%。在属水平上，筛选相对丰度前20的菌属（图1b），主要菌属为粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）以及醋杆菌属（Acetobacter），其相对丰度分别为20.0%及17.6%。此外，有害菌单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的丰度较高。

2.2 糟粕醋中微生物的功能

对宏基因组结果进行代谢通路注释，并统计其丰度（图2）。糟粕醋微生物群落的高丰度通路集中在有氧呼吸、肽聚糖生物合成、核苷酸合成及磷酸戊糖途径。其中，丰度前两位的2个代谢通路皆为细胞色素C介导的有氧呼吸通路，对应在发酵过程中醋酸菌、乳酸菌与酿酒酵母的好氧代谢。其余肽聚糖生物合成及核苷酸合成等通路支持微生物的增殖。

为解析糟粕醋微生物群落的基因功能谱，对测序得到的基因进行拼接，而后识别其功能基因，并与COG数据库进行比对，注释其COG功能分类，预测糟粕醋中微生物可能的功能。共获得4572条基因的功能注释，覆盖COG功能类别25个（图3）。根据COG功能分类体系，这些基因可归为4个功能大类，即：信息存储与处理（Information storage and processing）、细胞过程与信号（Cellular processes and signaling）、代谢（Metabolism）及特征模糊（Poorly characterized）。从功能大类分布来看，在信息存储与处理大类中，翻译、核糖体结构与生物合成（J，534），复制、重组与修复（L，278）和转录（K，273）中包含基因较多。在细胞过程与信号大类中，显著富集的类别包括细胞壁/膜/包膜生物合成（M，297）、翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣（O，231）及信号转导机制（T，203）。在代谢相关基因中，氨基酸转运与代谢（E，494）、能量产生与转化（C，411）、碳水化合物转运与代谢（G，411）3类中富集的基因较多。

2.3 传统分离、鉴定糟粕醋中的乳酸菌

通过富集培养后稀释涂布的方法对糟粕醋中的菌株进行分离，分离出40株菌的菌落形态接近目标菌株，然后进行菌种鉴定（图4a）。在分离得到的菌株中，有19株发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）、9株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、3株沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、2株头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis）、1株北方葡萄球菌（Staphylococcus borealis）、1株山羊葡萄球菌（Staphylococcus caprae）、1株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、1株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、1株巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）、1株腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）以及1株唾液链球菌（Streptococcus salivarius）。其中，占比最高的发酵粘液乳杆菌占所有菌株的47.5%，该菌在糟粕醋样本中相对丰度为5.5%，在富集培养过程中，其本身的相对丰度较高，可能更加适应培养环境，增殖较快，从而被大量分离。分离出的9株表皮葡萄球菌并不属于乳酸菌。统计分离菌株中乳酸菌及非乳酸菌菌株的数量（图4b），其中，乳酸菌菌株共有21株，有3个菌种，分别为发酵粘液乳杆菌、植物乳植杆菌、乳酸片球菌；非乳酸菌菌株共有19株。结果表明，传统分菌方法可以分离得到乳酸菌，然而菌种较单一，且分离得到部分非乳酸菌菌株，不能满足挖掘潜在益生菌资源的目的。

2.4 单细胞拉曼分选技术分离、鉴定糟粕醋中的乳酸菌

采用单细胞拉曼分选技术分离糟粕醋中的乳酸菌，共得到40株菌株，菌种鉴定结果见图5a。分离得到的菌株为10株霍氏明串珠菌（Leuconostoc holzapfelii）、8株乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、6株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、5株发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）、4株植物乳植杆菌斯特拉斯堡亚种（Lactiplantibacillus argentoratensis）、2株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、2株平房植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus pingfangensis）、1株山羊葡萄球菌（Staphylococcus caprae）、1株沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）以及1株食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。分离得到的菌株中，仅2株为非乳酸菌（图5b），乳酸菌菌株共38株，为8个菌种，分别为霍氏明串珠菌、乳明串珠菌、戊糖片球菌、发酵粘液乳杆菌、植物乳植杆菌斯特拉斯堡亚种、植物乳植杆菌、平房植物乳植杆菌以及食窦魏斯氏菌。其中，发酵粘液乳杆菌的相对丰度排在糟粕醋微生物相对丰度的前20，在分离得到的菌株中占比12.5%。结果表明，单细胞拉曼分选技术可以显微观察菌株形态，选择形态更相近的菌株，进而分离得到更多目标菌株，且分离的菌株物种更丰富，其中一些低丰度菌株也可以被分离出来。

2.5 传统分离培养方法和单细胞拉曼分选技术对比

为了更直观地对比传统分离培养方法和单细胞拉曼分选技术对菌株分离效率和效果上的差异。本研究从耗时、人员操作、乳酸菌占比、低丰度菌株数量、稀有菌株数量、成本6个方面对两种方法进行比较（表3）。单细胞拉曼分选技术耗时较短，人员操作较少，可以分离出更多的目标菌株，且可以分离得到丰度较低的菌株，如食窦魏斯氏菌，以及较稀有、文献报道较少的菌株如霍氏明串珠菌，而缺点是仪器和芯片的成本较高。

3 结论与讨论

本研究以糟粕醋为研究对象，对其进行宏基因组测序，探究其微生物组成和功能，并分别采用传统菌株分离方法和单细胞拉曼分选技术对其进行菌株分离，研究单细胞拉曼分选技术的优、缺点。通过分析宏基因组数据，发现糟粕醋中存在的主要菌株为巴氏醋杆菌、桥粘液乳杆菌、发酵粘液乳杆菌和酿酒酵母菌，存在的有害菌为单核细胞增生李斯特菌。吴慧玲的研究中，糟粕醋中的主要菌属为棒状杆菌属（Corynebacteriums）、葡萄球菌属（Staphylococcus）及乳杆菌属（Lactobacillus），主要有害菌为炭疽杆菌（Bacillus anthracis）、伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）等。而于笑瀚的研究中，糟粕醋的主要优势属为乳球菌属（Lactococcus）、粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）、乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）和醋杆菌属（Acetobacter），这与本研究基本一致。在不同研究中糟粕醋的微生物群不同，可能是因发酵底物不同，不同阶段的优势菌种不同或地理位置与发酵工艺的差别所致。

本研究分别采用传统培养分离方法与单细胞拉曼分选技术从糟粕醋样本中分离乳酸菌株。结果显示，传统分离方法获得的目标有益菌占比为52.5%，大量非目标菌株经培养和鉴定后被排除；而单细胞拉曼分选技术将目标菌株获得率提升至95.0%，显著减少了非目标微生物的无效分离。传统方法依赖菌落形态进行初筛，易受菌落相似性的干扰，导致非目标菌株的大量富集。相较之下，单细胞拉曼分选技术可直接基于微生物单细胞形态特征抓取目标，可有效规避球菌等的干扰，提高目标菌株在分离群体中的占比。

通过传统分离方法得到的菌株种类较单一，发酵粘液乳杆菌占比达47.5%，而采用单细胞拉曼分选得到的菌株中，发酵粘液乳杆菌占比仅为12.5%，说明除分离优势菌株外，更多低丰度菌株（如食窦魏斯氏菌）和较稀有、文献报道较少的菌株（如霍氏明串珠菌）也被分离出来。本研究采集的糟粕醋样本中的活菌较少，直接涂布难以分离菌株，故而采用先富集培养后稀释涂布的方法。这可能导致更适应环境的优势菌株生长迅速，在富集培养基中大量存在。发酵粘液乳杆菌是食品发酵中常用的乳酸菌之一，在酸性环境中稳定性较好，且在MRS培养基中生长迅速。本研究中，发酵粘液乳杆菌在糟粕醋样本中的相对丰度为5.5%，该菌可能在富集培养过程中成为优势菌，因而被大量分离。而单细胞拉曼分选技术采用“先分离后培养”的策略，有效规避了富集过程中优势菌的问题。将原始样本中的单细胞分离后再进行培养，更容易挖掘到更多低丰度的菌株。

综上所述，单细胞拉曼分选技术可在单细胞分辨率下直接基于细胞形态学特征抓取目标微生物，实现“先分离后培养”的分离策略，耗时短，且减少非目标微生物的盲目扩增与资源浪费，还可以分离出难培养的低丰度及稀有菌株，为复杂发酵微生态体系中益生菌的高效挖掘提供了全新思路。然而，目前单细胞拉曼分选技术仍面临芯片耗材单次使用成本高等问题。此外，本研究样本量有限，方法的可靠性和稳定性评估不够充分。后续工作需通过扩大样本多样性及增加试验重复次数，对单细胞拉曼分选技术进行更深入的验证。本研究为复杂微生物样本中菌株的分离、筛选提供了新的技术范式，同时为传统发酵食品功能微生物资源的深度开发提供数据基础。

原文链接：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=tjV0JOkNcjCBMEWAJoMPK_11r_YbG-oTBzMu4Fsq0ZZUhxbft4kkYDGhs6zzN0UAUfGoHsSnd59txGm8QTuxvdEjV-GLFP9UBwqAwXKg4-_X_TvM9k0ZVZX_xJd3R5L7_pvu2Blb_AAzWf4mI2iH54qL4AV6VySQG6AWm5rfwwsWqUJcD02XWw==&uniplatform=NZKPT&language=CHS