本期介绍江南大学李兆丰教授团队（第一作者孔昊存）发表在《中国食品学报》第24卷第3期特约专栏（食品生物技术）上的文章《源于类芽胞杆菌的低聚糖脱支酶底物特异性及其应用研究》。

1、研究背景及目的

近年来，伴随着淀粉深加工以及淀粉酶制剂行业的科技进步和人们消费结构的变化，淀粉糖市场规模逐步扩大，产量大幅增加，已成为淀粉深加工的支柱产品，也成为食糖市场的重要补充，被广泛应用于食品、医药、造纸等诸多行业。目前普遍采用双酶法生产淀粉糖，会造成目标产物得率低、副产物比例高等问题，因此淀粉糖的酶法生产中常会添加脱支酶辅助糖化。脱支酶是淀粉深加工产业的常用酶制剂，然而传统脱支酶难以完全满足淀粉糖绿色生产及副产物综合利用的需求，因此有必要挖掘适合的新型脱支酶。

2、研究方法

筛选并构建来源于类芽胞杆菌STB16的低聚糖脱支酶基因（oga）的枯草芽孢杆菌表达系统，实现低聚糖脱支酶的异源表达，并探究重组酶的酶学性质和底物特异性。

3、研究结果

枯草芽孢杆菌发酵上清液的酶活力可达162.33 U/mL，重组酶的最适反应温度50 ℃、最适反应pH值6.0，且专一地作用于底物中聚合度为1的分支的α-1,6-糖苷键。相比于其它类型的脱支酶（底物转化率低于检出限），重组低聚糖脱支酶对异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等异麦芽低聚糖具有更彻底的水解能力，底物转化率达97.4%~100%，且产物为葡萄糖，因此更适合用于处理葡萄糖母液，可使一次母液、二次母液和色谱分离尾液中葡萄糖含量分别提升3.6%，12.7%和34.4%。

4、结论

该研究实现了来源于类芽胞杆菌STB16的低聚糖脱支酶基因在枯草芽孢WB600系统中的分泌表达，并对其酶学性质和底物特异性进行研究。结果显示，重组低聚糖脱支酶的最适反应温度为50 ℃，最适反应pH值为6.0，具有相对较宽的pH值应用范围。重组低聚糖脱支酶对α-1,4-糖苷键无水解活力，只能专一地作用于底物中DP 1分支的α-1,6-糖苷键，产物为葡萄糖。与其它类型的脱支酶相比，重组低聚糖脱支酶对异麦芽低聚糖具有较高的水解活力，更适合用于处理葡萄糖母液中的异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等副产物。经低聚糖脱支酶处理后的母液中葡萄糖含量大幅提升。相关研究结果可为低聚糖脱支酶的挖掘和工业化应用提供参考。

图1  低聚糖脱支酶在枯草芽孢杆菌WB600中的异源表达与分离纯化

表1  低聚糖脱支酶的纯化结果

图2  重组低聚糖脱支酶的最适反应温度和热稳定性

图3  重组低聚糖脱支酶的最适反应pH和pH稳定性

图4  金属离子及EDTA对重组低聚糖脱支酶活性的影响

图5  底物类型对重组低聚糖脱支酶活力的影响

表2 底物类型对不同脱支酶活力的影响

图6  不同脱支酶处理对DE 16麦芽糊精链长分布的影响

表3  不同脱支酶处理对DE 16麦芽糊精链长分布的影响

图7  不同脱支酶处理对DE 16麦芽糊精的β-淀粉酶水解率的影响

图8  低聚糖结构对重组低聚糖脱支酶活力的影响

图9  异麦芽低聚糖经不同脱支酶处理前、后的HPAEC-PAD色谱图

表4  异麦芽低聚糖经重组低聚糖脱支酶处理后的产物分析

图10  麦芽低聚糖经重组低聚糖脱支酶处理前、后的HPAEC-PAD色谱图

图11  不同脱支酶的催化模式示意图

图12  葡萄糖母液经重组低聚糖脱支酶处理前后的HPLC色谱图

表5  葡萄糖母液经重组低聚糖脱支酶处理前、后的组成分析